Cromatografía de líquidos con detección de masas aplicado al estudio de moléculas de interés ambiental

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La cromatografía de líquidos (CL) es una técnica analítica fundamental para la separación, identificación y cuantificación de moléculas de interés presentes en mezclas complejas, que sean solubles en agua. Su aplicación medio ambiental es esencial para garantizar la calidad del agua, así como el cumplimiento de normativas ambientales. Por ejemplo, la cuantificación de plaguicidas en agua potable y superficial es crucial, ya que su presencia por encima de los límites permitidos puede afectar la salud humana y los ecosistemas, provocando toxicidad aguda o crónica en organismos acuáticos y bioacumulación en la cadena trófica. En el caso de aplicar la CL para estudiar la presencia de contaminantes en suelo y residuos, es necesario realizar una extracción y una limpieza de este extracto antes de su análisis asegurando que el extracto final esté disuelto en solventes orgánicos compatibles con agua.

Para su análisis por CL, las muestras ambientales deben estar en estado líquido, aunque las moléculas de interés ambiental pueden extraerse previamente de matrices sólidas o semisólidas mediante tratamientos físicos o químicos. Generalmente, las muestras se toman de diversas fuentes ambientales, como aguas superficiales (ríos, lagos, mares), aguas residuales, sedimentos, suelos, aire (a través de filtros) o incluso tejidos biológicos (peces y plantas), dependiendo del objetivo del estudio. Estos tratamientos pueden incluir derivatizaciones, extracciones líquido-líquido (L-L), sólido-líquido (S-L) o en fase sólida (SPE).

La elección del tratamiento depende del tipo de muestra y las propiedades específicas de las moléculas, como sensibilidad a la luz, termolabilidad o polaridad.

La cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (UPCL-MS/MS) permite no solo la cuantificación precisa de contaminantes, sino también el estudio de su degradación y transformación en el ambiente. Es importante destacar que, para que el espectrómetro de masas pueda detectar las moléculas, estas deben estar ionizadas, es decir, cargadas eléctricamente. Un ion es un átomo o molécula que ha ganado o perdido electrones, lo que le confiere una carga positiva (catión) o negativa (anión). El espectrómetro de masas no detecta moléculas neutras, ya que su funcionamiento se basa en la medición de la relación masa/carga (m/z) de los iones. Esto es importante para desarrollar estrategias de remediación más eficientes y sostenibles. Conocer los Coordinación de Ingeniería Ambiental cambios en las moléculas, como la formación de subproductos de degradación, ayuda a predecir su impacto ambiental y a diseñar procesos de descontaminación más efectivos. Además, la capacidad de rastrear moléculas específicas en matrices complejas, como sedimentos o tejidos biológicos, aporta información valiosa para la toma de decisiones en ingeniería ambiental.

En el contexto anterior, la CL actúa como una herramienta de separación, mientras que la espectrometría de masas permite identificar y detectar las moléculas aisladas mediante sus espectros de masas comparados con materiales de referencia o estudios complementarios como Espectroscopia Infrarroja (FT-IR) y Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Una ventaja clave de este acoplamiento es su capacidad para separar y analizar diferentes moléculas en el detector de masas dentro de un mismo pico cromatográfico que, utilizando otros detectores, no podrían ser resueltas. Un ejemplo de esto se muestra en la figura 1, donde se presenta el análisis de un estándar en agua que genera un único pico cromatográfico, a pesar de contener tres iones diferentes.

Este pico puede desglosarse en tres cromatogramas independientes, cada uno correspondiente a un ion específico, los cuales pueden ser observados y estudiados de manera individual en sus respectivos cromatogramas y espectros de masas.

Calidad en el Laboratorio de Ingeniería Ambiental (LIA) 

El LIA opera bajo un Sistema de Gestión de la Calidad certificado por la norma ISO 9001:2015, que incluye dos procesos principales: determinaciones analíticas y diseño y desarrollo de métodos. Si el método solicitado no está implementado, se desarrolla uno nuevo, evaluando su desempeño antes de su aplicación.

Para métodos ya establecidos, las muestras se analizan directamente, y los resultados se entregan en informes que cumplen con los requisitos de la norma ISO 17025:2017, aunque el LIA no esté acreditado. Estos informes han sido bien valorados en auditorías por su claridad y utilidad para la investigación.

En conjunto, estas acciones garantizan que el análisis cumpla con los objetivos de investigación y los estándares de calidad establecidos, consolidando a la LC-MS/MS como una herramienta indispensable para el estudio de moléculas de interés ambiental.

El equipo UPLC-MS/MS-PDA del Laboratorio de Ingeniería Ambiental

​El Laboratorio de Ingeniería Ambiental (LIA) cuenta con un equipo UPLC-MS/MS-PDA, el cual combina un cromatógrafo de ultra eficiencia con un detector de masas y uno de arreglo de diodos. A diferencia del HPLC convencional, este sistema soporta presiones de hasta 15,000 psi, lo que reduce significativamente los tiempos de corrida y optimiza los análisis. El detector de masas ofrece configuraciones MS y MS/MS, siendo esta última especialmente útil para mejorar la especificidad en la detección de moléculas.

Por su parte, el detector PDA funciona como un detector UV-Vis, proporcionando una resolución superior en el rango espectral. Cuando las moléculas cumplen con los requisitos para ser analizadas por ambos detectores, estos pueden utilizarse simultáneamente, mejorando la calidad y versatilidad de los resultados. Este servicio analítico, dirigido principalmente a académicos, requiere una comunicación efectiva y detallada desde la planificación del muestreo hasta la entrega final de los resultados.

Cribado, Identificación y Cuantificación de Moléculas

El cribado tiene como objetivo detectar muestras que puedan contener moléculas de interés ambiental. Este enfoque permite analizar de manera simultánea un gran número de analitos en una cantidad significativa de muestras, logrando, por ejemplo, procesar hasta 100 analitos en 1,000 muestras con un solo método de extracción.

Tras el cribado inicial, donde se identifican muestras y moléculas de interés potencial, el siguiente paso es la confirmación de identificación. Este proceso requiere métodos de tratamiento y análisis más específicos, diseñados para aumentar la eficiencia de la extracción y asegurar la detección de los iones característicos en las proporciones esperadas. La identificación es un paso crucial, ya que garantiza que la cuantificación posterior sea válida y confiable. Para confirmar una molécula candidata identificada durante el cribado, el método de tratamiento de muestra y análisis debe optimizarse para esa molécula en particular. Esto incluye aumentar el porcentaje de extracción y observar los iones característicos en las proporciones esperadas.

La confirmación de identidad se logra principalmente mediante el uso de un material de referencia, aunque también pueden aplicarse criterios normativos, como la proporción porcentual del ion de identificación. En el caso de moléculas de reciente investigación, estos criterios pueden derivarse de artículos científicos. Una vez cuantificadas, los resultados pueden compararse con los límites máximos permitidos (LMP) establecidos en normativas, en caso de existir.

Es importante destacar que, aunque este tipo de proceso es una herramienta valiosa, su implementación completa requiere de recursos y capacidades específicas que pueden variar según el laboratorio. Por ello, el enfoque en el LIA se centra en contribuir a la investigación, optimizando los procesos analíticos dentro de nuestras posibilidades técnicas y operativas.

Observación de moléculas producto del metabolismo o procesos de degradación

En la mayoría de estos casos, la molécula de investigación posiblemente se desconoce y/o no se cuenta con el material de referencia con el que se pueda identificar y cuantificar, entonces se trabaja con dos consideraciones: 1) Detectar las moléculas más estables y que se encuentran en suficiente concentración que permita su detección y 2) Los resultados de la abundancia se pueden lograr en porcentaje relativo a la respuesta de otro analito, comúnmente el analito del cual provienen.

Las relaciones m/z (masa/carga) que se buscan en el equipo de UPLC-MSMS pueden provenir de publicaciones científicas, del conocimiento de las rutas metabólicas o de los mecanismos de degradación.

El conocimiento profundo del comportamiento químico de las moléculas es esencial para diseñar estrategias analíticas efectivas. Propiedades como la polaridad, el peso molecular y la estabilidad química pueden variar significativamente con factores como el pH, la temperatura y la exposición a agentes externos. Por ejemplo, el pH no solo afecta la solubilidad y la estabilidad de la molécula, sino también su estado de ionización, lo que influye directamente en su comportamiento durante el análisis por LC-MS.

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Un ejemplo representativo es la saxitoxina, una neurotoxina que se encuentra principalmente en moluscos bivalvos, como mejillones, almejas y ostras, así como en su cadena trófica, donde se acumula a través del consumo de microalgas tóxicas, como Alexandrium spp., productoras de esta toxina. Esta molécula, cuyo estado de ionización y relación masa/carga (m/z) varían significativamente en función del pH del medio, representa un desafío analítico. Tal como se ilustra en la Figura 2, un cambio en el pH puede provocar la transformación de la molécula desde un estado cargado positivamente a un estado neutro, lo que puede dificultar su detección o incluso llevar a su degradación al formar un hemicetal y/o perder el grupo carboxamida. Además, este cambio puede alterar el ion objetivo para la detección, como m/z 141.1, 150 y 300, impactando directamente en la sensibilidad y reproducibilidad del análisis.

Cuando el análisis se enfoca en un ion específico, como el de m/z 300, es crucial ajustar el método para garantizar que las condiciones experimentales favorezcan la estabilidad de dicho ion. Este caso destaca la importancia de diseñar una estrategia analítica robusta desde el inicio, que considere no solo los posibles cambios en las propiedades químicas de la molécula, sino también la influencia de las condiciones experimentales en su detección y cuantificación.

Figura 2. Ejemplo de la afectación de los cambios de pH sobre la detección en espectrometría de masas​

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Bibliografía

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